科研进展Ataxin3免疫检测为S

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Ataxin-3免疫检测为SCA3的等位基因特异性靶定奠定了基础

注：本文不是一篇常规的研究性论文，而是对一篇论文的评论文章。文章包括摘要、实验细节以及专家点评3个部分；研究成果分为2点。

研究成果

（一）

这项研究主要提出了一项检测技术，称之为Ataxin-3免疫检测，这项检测技术可以特异性地检测出SCA3患者脑脊液和血浆中的突变蛋白。这项检测技术的主要应用场景是：评价SCA3临床治疗方法的效果。它的重要性在于，目前临床上缺乏评估SCA治疗效果的方法。其原理是：SCA3疾病的发生是由于ATXN3基因的CAG重复扩增，Ataxin-3蛋白扩增的聚谷氨酰胺区域导致了聚集体并引起了功能毒性的增加，从而引起小脑、脊髓和其他区域的神经毒性。在ATXN3等位基因中，突变型和正常型都是有CAG的扩增，但是突变型的CAG序列更长，从而导致突变蛋白中聚谷氨酰胺区域更长，也就为抗体靶定提供了更多位点，从而放大了信号，并使得突变蛋白可被特异性地检测到。突变型Ataxin-3蛋白虽然可以被特异性地检测到，但在已有的研究对象中，并未发现突变型蛋白的表达水平与发病年龄、严重程度等有正相关性，这或许对于SCA3预后指标不能起到很好的表征作用。（二）研究发现，大多数SCA3患者的突变等位基因携带一个独特的SNP，这为突变等位基因的特异性靶定奠定了基础。在ATXN3等位基因中，突变型和正常型都是有CAG的扩增，突变型才是引起疾病的罪魁祸首，所以在开发治疗疾病的方法时，最好的办法就是特异性地靶定突变型基因，并降低它的表达，而避免伤及无辜的正常型基因。SNP是指突变的单个核酸位点，研究发现，大多数患者突变基因上同时携带一个SNP，这就是区分突变型和正常型基因的有力武器。可以推测，后续在治疗方案上，比如使用RNA干扰技术治疗SCA3时，可以借助此SNP区分突变型与正常型，从而特异性地开展治疗。专家认为，这个方法对于开发SCA3临床治疗策略是有重要意义的，可以评估药物的有效性。SNP位点的发现为后续开发特异性沉默突变基因奠定了基础。文章摘要研究者报道，双抗体检测方法可以检测出脊髓小脑共济失调患者的脑脊液和血浆中的突变蛋白，并且在小干扰RNA进行抗重复扩增处理后，检测信号会减弱。像许多类型的脊髓小脑共济失调和亨廷顿病等由于CAG重复扩增导致的遗传病，在开发针对此类疾病的治疗方法中，通过反义寡核苷酸或者RNA干扰来减少突变蛋白的产生是一种有希望的策略。但是在很多情况下，这些方法的临床开发受制于生物标志物的缺失。生物标志物是用来表征推定治疗已经靶定了目标，并减少了毒性蛋白。在年10月21日发表在《ScienceTranslationalMedicine》杂志的一项新研究中，研究者或许已经克服了SCA3的这一阻碍。研究者报道了一种双抗体检测方法可以检测到脑脊液和血浆中的突变蛋白，并且当用小干扰RNA对表达突变蛋白的成纤维细胞进行抗重复扩增处理后，可以检测到信号的减弱。在同一篇研究中，作者表明大多数SCA3患者的突变等位基因携带一个独特的SNP（单核苷酸多态性），这为重复扩增的等位基因特异性靶定奠定了基础，这可能是比同时降低突变等位基因和正常等位基因表达更为安全的治疗策略。休斯顿卫理公会研究所神经科学研究计划主任、没有参与到这项研究里的TetsuoAshizaw博士评论：这是一项开创性的研究，我对（双抗体）测定的质量印象深刻。研究SCA3治疗方法的公司可能对此会非常感兴趣。SCA3是由于ATXN3基因的CAG重复扩增引起的，CAG重复扩增导致了小脑、脊髓和其他区域的神经变性，以及进行性共济失调和其他临床症状。Ataxin-3蛋白扩增的聚谷氨酰胺区域导致了聚集体并引起了功能毒性的增加，但具体的机制还不清楚。这项研究的共同作者佛罗里达杰克逊维尔市梅奥诊所神经病学教授ZbigniewK.Wszolek说：在生物流体中有一个可检测的标志物非常重要。目前为止，我们只有临床标记，但是这非常不精准。这就阻碍了药物试验，因为没有任何工具可以判断药物的有效性。这项方法的发展基于杰克逊维尔梅奥诊所神经科学教授、本文的共同作者LeonardPetrucelli博士的工作，他曾经开发了一种类似的检测方法，用来检测渐冻症中由C9orf72基因引起的含重复序列的蛋白质。Petrucelli博士说，借助聚谷氨酰胺的扩增特点，我们可以在SCA3中应用相似的策略。这项实验中，一种抗体用来检测Ataxin-3蛋白，包括正常型和突变型蛋白。这一步是用来区分其他蛋白的“捕获”步骤。第二步是绑定聚谷氨酰胺区域。Petrucelli博士说，尽管正常蛋白也有聚谷氨酰胺区域，但在突变蛋白中聚谷氨酰胺区域更长，也就为抗体靶定提供了更多位点，从而放大了信号，并使得突变蛋白可被特异性地检测到。研究细节研究小组以53位SCA3患者，4位携带ATXN3扩增携带者（尚未出现对应病症），21位其他类型SCA患者，以及56位健康个体为实验对象，测试了双抗体检测方法的灵敏度和特异性。该方法可以识别到SCA3患者脑脊液和血浆中升高的突变型ataxin-3，可以很轻松地与健康人和其他类型的共济失调患者区分开。ATXN3扩增携带者的突变型ataxin-3水平比患者低。这与另一个研究团队测试血浆中ataxin-3的水平，结果是一致的，研究对象包括40名SCA3患者，2位携带者，30位健康个体为对象。实验表明，在患者的成纤维细胞中，小干扰RNA可以降低突变基因的表达量，这也证明了其作为治疗效果标记物的潜在用途。在患者和对照组之间，ataxin-3的数量在血浆和脑脊液中存在显著差异。然而在单个患者体内，血浆和脑脊液中的ataxin-3蛋白质的水平没有相关性。Petrucelli博士表示，这表明ataxin-3的外周池并非主要来自中枢神经系统，更是来自外周组织。实验分析结果与疾病持续时间、严重程度、发病年龄或CAG重复长度无相关性，这或许阻碍该测定方法作为预后指标的实用性。Petrucelli博士补充道，因为尽管携带者的ataxin-3水平低，但是仍然可被检测到，这表明临床症状和蛋白质水平并不是同步的。这是否会称为临床实验中的一个问题尚待观察。他说：“我们已经开发出了一种用于靶标结合的标志物，可以测量易于获得的生物流体中的蛋白质水平，随着如此多的公司开发反义寡核苷酸和其他靶向方法，此类生物标志物是治疗领域的前沿。"对于SCA3来说，理想的RNA靶向治疗策略是减少突变等位基因的表达，而不影响正常基因的表达。Petrucelli博士的研究团队曾研究过ATXN3基因的一个SNP，这个SNP被报道与SCA3有关，但除此以外没有其他特征。这个SNP位于CAG扩增的下游，将酪氨酸密码子转变为终止密码子，当它也包含引发疾病的扩增区时，会增加蛋白质的聚集倾向。携带SCA3突变的个体中，78%的人SNP和CAG扩增区在同一个等位基因上，这一比例比非患者组高很多。专家评论

芝加哥大学神经学教授ChristopherGomez评论说：“这里报告的结果是对于开发SCA3治疗方法过程中真正重要的步骤。检测生物流体中的突变蛋白应该是一个很好的生物标志物，而在高比例的患者中鉴定SNP为等位基因特异性沉默铺平了道路，这可能非常有用。”

休斯顿卫理公会研究所的Ashizawa博士评论说：“这种分析方法有可能在临床试验中发挥非常重要的作用，以确保药物达到预期效果。这很有可能是这个研究将产生的最大影响。”

至于缺乏与临床特征的相关性是否是一个弱点，Ashizawa博士认为，这可能是意料之中的。因为导致疾病的细胞事件可能在临床表现之前的几年起作用，并且可能不需要增加蛋白质使疾病变得明显。“我不认为这是一个严重的缺点，”他补充说。

Ashizawa博士认为，等位基因特异性敲除ataxin-3是否必要尚不清楚，因为在小鼠身上进行的实验表明，至少在短期内是安全的。“但是我们不知道长期减少ataxin-3是否有效果，”他说，“敲除等位基因特异性突变体，会更干净、更安全和更有意义。”

*名词解释

(1)Ataxin-3:Ataxin-3是一种重要的去泛素化酶,正常情况下,它参与基因转录,蛋白代谢,磷酸化以及自身泛素化水平的调节.然而突变的Ataxin-3的表达可致转录失调,导致细胞毒性和神经退行性变疾病,如脊髓小脑共济失调3(SCA3)。Ataxin-3的异常不仅能导致神经性病变,而且据最近世界各地的研究表明,AT3的失调可能涉及一些人类癌症或者癌症前期病变(如胃癌,乳腺癌,肺癌,睾丸癌,肝硬化等)的发病机制。

(2)Immunoassay：免疫测定法是指利用免疫学原理，以待测物作为抗原或抗体从而测定样品中待测物质含量的方法。

(3)Allele：等位基因，一对同源染色的相同位置上控制着相对性状的一对基因。

(4)SingleNucleotidepolymorphism(SNP)：单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性

PrudencioM,Garcia-MorenoH,Jansen-WestKR,etal.Towardallele-specifictargetingtherapyandpharmacodynamicmarkerforspinocerebellarataxiatype3